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DISCO-seq 開啟三維單細胞轉錄體學

單細胞轉錄體學（single-cell transcriptomics）的研究是把組織分離成一顆顆細胞，逐一讀取每個細胞個別正在表達哪些基因，藉此分辨細胞類型、活化狀態與疾病環境下細胞群如何改變。但當組織被打散成單細胞懸浮（single-cell suspension）或單核懸浮（single-nuclei suspension）之後，研究者無法知道這些細胞原本在生物體內微環境中是處於什麼空間狀態。


於是空間轉錄體學（spatial transcriptomics）補上了位置資訊，但它也有另一個限制，多數方法仍依賴薄切片進行分析。切片可以保留局部組織中的 RNA，但畢竟這方法只從其中一個切面獲得資訊，若病變分散在完整器官的不同角落，或只以少量細胞形式出現在遠端區域，抑或研究者也可能根本沒有切到那一片關鍵的區域，那就會錯失準確的判讀。


空間轉錄體學的其中一種最常見的方法。組織取出後製備為薄切片，並放置於含有寡核苷酸探針的空間捕捉晶片上。晶片表面每一個捕捉區域都帶有 poly(dT) mRNA 捕捉序列、UMI、空間條碼與定序引子。組織中的 mRNA 釋放後會被鄰近位置的探針捕捉，使每一段轉錄本同時保留其來源位置資訊。接著將 mRNA 反轉錄成 cDNA，之後切割探針、收集 cDNA，透過次世代定序讀取序列、UMI 與空間條碼。最後定序資料經由電腦分析後，可將基因表達量重新對應回組織切片中的原始位置（圖片來源：Isnard P and Humphreys BD. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）
空間轉錄體學的其中一種最常見的方法。組織取出後製備為薄切片，並放置於含有寡核苷酸探針的空間捕捉晶片上。晶片表面每一個捕捉區域都帶有 poly(dT) mRNA 捕捉序列、UMI、空間條碼與定序引子。組織中的 mRNA 釋放後會被鄰近位置的探針捕捉，使每一段轉錄本同時保留其來源位置資訊。接著將 mRNA 反轉錄成 cDNA，之後切割探針、收集 cDNA，透過次世代定序讀取序列、UMI 與空間條碼。最後定序資料經由電腦分析後，可將基因表達量重新對應回組織切片中的原始位置（圖片來源：Isnard P and Humphreys BD. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）

DISCO-seq 正是為了解決這個問題而發展出來的技術，它的核心想法是先讓完整組織或整隻小鼠變透明，保留三維解剖結構，再用層光顯微技術（light-sheet microscopy）從整體尺度觀察細胞、病灶或標記蛋白的位置，接著根據這些三維影像精準取出真正符合觀察目的的區域，進行單細胞或單核轉錄體分析。


這項技術最大的難關在於 RNA，許多組織透明化方法使用強烈的有機溶劑，雖然能讓原本不透明的組織變得清澈，卻也常常破壞到 RNA，使後續轉錄體分析結果變得不可靠。研究團隊因此測試不同灌流液、固定方式與透明化試劑，最後建立出一套能兼顧透明化與 RNA 保存的流程。使用經過優化的四氫呋喃/二氯甲烷（tetrahydrofuran/dichloromethane，THF/DCM）溶液執行透明化步驟，之後再透過逐步移除透明化殘留的疏水性物質，把樣本從疏水性有機溶劑環境帶回適合 RNA 偵測的水相環境。DISCO-seq 處理後的腦組織仍可取得定序等級的 RNA，純度與完整性接近新鮮或固定後的對照樣本，也未明顯扭曲組織內原本的細胞組成，沒有把三維影像的優勢建立在犧牲分子品質之上。


為了測試 DISCO-seq 技術在疾病研究所發揮的能力，研究者將其應用於小鼠膠質母細胞瘤（glioblastoma）模式。傳統正電子發射斷層掃描（positron emission tomography）影像可以看到較大的腫瘤位置與生長趨勢，但受限於解析度，難以捕捉單細胞層級的腫瘤擴散。DISCO-seq 搭配全腦透明化與三維成像後，研究者在完整腦中觀察到主要腫瘤塊，也看見遠離主腫瘤、沿著腦區散布的微小腫瘤細胞聚集，也可見腫瘤細胞經由胼胝體向對側區域擴散的狀態。這些微小病灶的體積只占腫瘤總量的一小部分，卻分布在多個皮質與皮質下區域，代表它們具有潛在的病理意義，並可能是傳統影像很容易忽略的擴散線索。


膠質母細胞瘤模式中離散腫瘤細胞與遷移路徑的偵測（A）膠質母細胞瘤小鼠模式與後續分析流程示意圖。研究者將帶有綠色螢光蛋白（eGFP）標記的 SB28 膠質母細胞瘤細胞注入小鼠腦內，之後進行腫瘤追蹤、全腦透明化、三維影像擷取與後續區域分析；（B）透明化全腦的三維影像顯示，除了大型主要腫瘤之外，腦內仍可觀察到少量分散的腫瘤細胞或小型腫瘤細胞聚集區。綠色訊號來自 eGFP 標記腫瘤細胞，影像也顯示部分腫瘤細胞可能沿胼胝體向對側腦區移動；（C）將膠質母細胞瘤小鼠全腦的正電子發射斷層掃描（PET）、電腦斷層掃描（CT）與層光顯微影像進行配準，並套合以 Allen brain atlas 為基礎的腦區標註，使腫瘤分布能對應到具體解剖區域（圖片來源：Bhatia HS et al. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）
膠質母細胞瘤模式中離散腫瘤細胞與遷移路徑的偵測（A）膠質母細胞瘤小鼠模式與後續分析流程示意圖。研究者將帶有綠色螢光蛋白（eGFP）標記的 SB28 膠質母細胞瘤細胞注入小鼠腦內，之後進行腫瘤追蹤、全腦透明化、三維影像擷取與後續區域分析；（B）透明化全腦的三維影像顯示，除了大型主要腫瘤之外，腦內仍可觀察到少量分散的腫瘤細胞或小型腫瘤細胞聚集區。綠色訊號來自 eGFP 標記腫瘤細胞，影像也顯示部分腫瘤細胞可能沿胼胝體向對側腦區移動；（C）將膠質母細胞瘤小鼠全腦的正電子發射斷層掃描（PET）、電腦斷層掃描（CT）與層光顯微影像進行配準，並套合以 Allen brain atlas 為基礎的腦區標註，使腫瘤分布能對應到具體解剖區域（圖片來源：Bhatia HS et al. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）

接著研究者根據三維影像選取不同腦區，包含主要腫瘤塊，還有遠端含有稀疏腫瘤細胞的區域，再進行單細胞 RNA 定序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）。結果顯示主要腫瘤塊中的小膠質細胞（microglia，巨噬細胞的一類）與血液浸潤後分化的巨噬細胞（macrophage）明顯增加，並表現出與膠質母細胞瘤相關的基因，例如 C1qa、Ctss、Ctsb、Mpeg1 等。腫瘤附近的神經元也出現明顯轉錄變化，包含突觸訊號、囊泡運輸與神經活動相關基因上升，部分壓力調節與穩態相關基因下降，代表腫瘤明確會重塑周圍神經元、小膠質細胞與免疫細胞的狀態。而遠端區域呈現介於正常組織與腫瘤之間的分子特徵，可看出腫瘤微環境的改變可能早已延伸到肉眼或傳統影像尚未能清楚辨識的地方。


膠質母細胞瘤腦組織（Glioblastoma）相較於對照組（Sham）的腦組織前 10 個差異表達基因。上方點圖顯示小膠質細胞的不同基因表達差異，中間點圖則顯示 glutamatergic 神經元，下方點圖則顯示 GABAergic 神經元（圖片來源：Bhatia HS et al. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）
膠質母細胞瘤腦組織（Glioblastoma）相較於對照組（Sham）的腦組織前 10 個差異表達基因。上方點圖顯示小膠質細胞的不同基因表達差異，中間點圖則顯示 glutamatergic 神經元，下方點圖則顯示 GABAergic 神經元（圖片來源：Bhatia HS et al. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）

最後研究者把 DISCO-seq 推向更大的尺度，整隻小鼠。小鼠靜脈注射螢光標記的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的棘蛋白 S1 結構域 30 分鐘後，進行全身透明化與層光成像，觀察棘蛋白 S1 結構域在不同器官中的分布。發現 S1 在肝臟、肺、腸道與腎臟等器官有明顯累積，而心臟、骨骼肌與骨髓相對較少。進一步觀察小腸時，發現十二指腸與迴腸之間具有不同的 S1 分布模式，並選取這些區域進行單細胞 RNA 定序。


新型冠狀病毒的棘蛋白 S1 結構域在小鼠體內的分佈，發亮區域為波長 665–670 nm 的紅光，照片經電腦改為較容易觀察的淡藍色（圖片來源：Bhatia HS et al. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）
新型冠狀病毒的棘蛋白 S1 結構域在小鼠體內的分佈，發亮區域為波長 665–670 nm 的紅光，照片經電腦改為較容易觀察的淡藍色（圖片來源：Bhatia HS et al. (2025)，採用 CC BY-NC-ND 4.0 授權）

從小腸分析看出短短 30 分鐘 S1 的出現並未大幅改變整體細胞組成，卻已經引發區域與細胞類型特異性的轉錄反應。十二指腸近端腸上皮細胞上調與粒線體呼吸、氧化磷酸化與能量代謝相關的基因；遠端腸上皮細胞則啟動壓力反應、屏障調整與免疫互動相關程序。迴腸中的潘氏細胞（Paneth cell）強烈表達免疫與分泌相關的基因，巨噬細胞上調發炎與抗原呈現基因，T 細胞也出現活化與細胞毒性相關標記。這些說明即使相鄰腸段面對同一種外來蛋白質，也可能因局部微環境、免疫結構與組織特性不同而產生截然不同的反應。


過去生物研究者常問某個基因在哪些細胞表達，現在透過 DISCO-seq 技術則可以先從完整器官或完整身體中找出真正異常或有意義的位置，再回頭追問這些位置中的細胞正在啟動什麼基因的轉錄，讓罕見病灶、遠端浸潤、區域性免疫反應與全身性疾病分布有機會被更完整地捕捉。雖然這項方法仍仰賴區域解剖，尚未達到在完整動物體內直接讀取所有細胞轉錄體的程度，但它已經把三維解剖影像與單細胞分子分析連接成一條實用而強大的路徑。


作者：水也佑


參考文獻：

  1. Bhatia HS et al. (2025). DISCO-seq: 3D single-cell transcriptomics of intact biological systems. bioRxiv.

  2. Isnard P and Humphreys BD. (2025). Spatial Transcriptomics. The American Journal of Pathology.


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